激光共聚焦顯微鏡樣品製備有那些注意事項？

激光共聚焦顯微鏡樣品製備的注意事項主要包括以下幾個方麵：

一、樣品選擇與準備

樣品類型：樣品可以是固定的或活的組織，也可以是固定的或活的貼壁培養細胞。對於懸浮細胞或懸浮粒子，應使用共聚焦顯微鏡專用的培養皿承載樣品進行觀察。

樣品厚度：樣品的厚度應適中，一般為1~2mm，以便於激光穿透和成像。

二、載玻片與蓋玻片的選擇與處理

質量選擇：載玻片和蓋玻片應選擇質量好、光潔、無雜質的。重要實驗需提前檢查其光學特性，確保無熒光幹擾。

厚度要求：蓋玻片的厚度應小於0.17mm，載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間。這樣的厚度配置有助於獲得清晰的成像效果。

處理步驟：蓋玻片使用前需用玻璃洗液浸泡處理一天以上，鉻酸浸泡過夜，去離子水衝洗掉殘存的洗液後，再用無水乙醇浸泡待用。臨用前需在酒精燈上過火滅菌處理。

三、熒光染料的選擇與標記

染料選擇：由於激光共聚焦顯微鏡使用單一波長的激光作為光源，因此熒光染料的選擇應根據激光器的波長來確定。如果在同一樣品中有多種熒光染料標記，應確保它們的發射波長不重疊，以避免串色問題。

標記方法：樣品需經熒光探針標記（可單標、雙標、三標），標記方法應確保染料與樣品充分結合且不影響樣品的生理狀態。

四、樣品的固定與封片

固定方法：對於需要固定的樣品（如組織切片），應采用適當的固定劑進行處理，以確保樣品形態的穩定性和染色的均勻性。

封片處理：如果樣品隻需觀察一次且不易淬滅熒光，可使用一定濃度的甘油混合物封膜。如果樣品需要放置一段時間並多次拍攝，應使用抗熒光淬滅的封片劑以減少熒光信號的損失。固定樣品常用PH8.5-9的PBS配製的甘油封片。

五、其他注意事項

操作規範：在製備樣品過程中應嚴格遵守操作規程，避免汙染和損壞樣品。

安全防護：激光共聚焦顯微鏡中的激光發射管使用壽命有限且價格昂貴，因此在操作過程中應注意保護激光管免受損壞。同時應避免暴露在中等功率和高功率的激光輻射中，特別是不要注視激光束。

儀器管理：激光共聚焦顯微鏡作為使用率極高的大型精密儀器，其正常運轉離不開科學的日常管理。應指定儀器負責人負責儀器的開關機、日常維護和狀態檢查等工作。

綜上所述，激光共聚焦顯微鏡樣品製備涉及多個方麵的注意事項，包括樣品選擇與準備、載玻片與蓋玻片的選擇與處理、熒光染料的選擇與標記、樣品的固定與封片以及操作規範和安全防護等。隻有嚴格遵守這些注意事項才能確保獲得高質量的成像結果並保護儀器免受損壞。